血中腫瘍DNAのPCR増幅：デジタルPCRの応用

通常PCRによる遺伝子検査ではリアルタイムPCRを用いる。しかしリキッドバイオプシーでの標準はデジタルPCRである。リキッドバイオプシーでは微量の変異を検出する必要があり、リアルタイムPCRの感度では不十分なためである。

血中腫瘍ＤＮＡの生化学的性質

腫瘍組織由来の血中遊離ＤＮＡの存在は、１９７０年代以降報告があったが、癌細胞のゲノム上の異常を指標にしたctDNA検出は１９９０年代から始まった。現在につながる本格的な研究開発が始まったのは２０００年代以降、デジタルPCRの応用以降、と考えるのが適切であろう。

遊離ＤＮＡは細胞死の結果細胞外に放出されているため通常のゲノムDNAと異なり約１７０塩基対に分解されている。半減期はきわめて短い。分娩後の胎児由来cfDNAの消失動態から16.5分、術後の血中腫瘍ＤＮＡの消失動態から約２時間と推定されている。私たちのデータでは、健常人癌患者を問わず血液１ml中には、平均３０００ゲノムに相当するcfDNAが含まれている。従って血液１mlあたりの血中腫瘍ＤＮＡは０〜３０００ゲノム相当になるが、進行癌患者の中には血中腫瘍ＤＮＡ量が著しく増加する症例もある。血中腫瘍ＤＮＡの生成メカニズムはわかっていないが、核内DNAは細胞死以外で細胞外に放出されることは考えられないので、細胞死の結果である、とはいえる。原発巣だけではなく全身のあらゆる腫瘍のDNAを含んでいる。また、体内半減期が他のバイオマーカーより極端に短いことから積極的に除去するメカニズムがあると思われるが、よくわかっていない。一般的に腫瘍量と血中腫瘍ＤＮＡ量は相関しているが、腫瘍塊があっても血中腫瘍DNAが出現しない症例もある。最近の初期肺癌に関する研究で、壊死病変、リンパ浸潤、高細胞増殖能（Ki67インデックス高値）により、血中腫瘍ＤＮＡ出現頻度が上昇することがわかった。進行癌の患者では高頻度（７０〜１００％）でみられるが、初期癌では出現頻度は低い。また、抗がん剤等による細胞破壊に伴い出現する血中腫瘍ＤＮＡもある。

一般的なCEAやCA-19-9などの癌バイオマーカーは癌細胞の表面上のタンパク質かあるいは分泌蛋白である。血中腫瘍ＤＮＡは量以外に、塩基配列が重要な情報である点が他のバイオマーカーと決定的に異なる。また、半減期が他の生体物質と比較して極めて短いため動態変化が速い。従って時間分解能は高いが、DNAのもとの組織はわからないため空間分解能はない、といえる。血中腫瘍DNAの諸性質について図１にまとめた。

f:id:kkatogo13:20210323133633p:plain — 図１．血中腫瘍DNAの生化学的特徴と得られる情報。

PCR増幅に関する注意点

前項で示したように、血中腫瘍DNAは約１７０塩基対に分解されているため、必ずしも２つのPCRプライマー配列がともに断片化されたDNA上に存在するわけではない。PCRの鋳型になる分子は一部である。PCRが可能な（プライマーが２つともDNA断片上にある）分子数の比率は以下の式で算出できる。

有効分子数比率 m=(170-L)/ (2L+170) L: PCR断片の大きさ

全血1ml中遊離DNA 10 ngで、これは~3000ゲノムに相当する。L=100 なら 3000xm = 778分子/全血1ml となり、PCR可能な分子は３分の１以下である。

リアルタイムPCRとデジタルPCR

リアルタイムPCRでは変異部位に特異的な蛍光標識プローブで変異のあるDNAを検出する。変異特異的プローブで増幅過程を追跡し、蛍光検出閾値を越えたときのサイクル数（Ct, cycle threshold）を指標に定量検出を行う。変異特異的標識プローブにはTaqMan probe, Scorpin ARMS, PNA-LNA PCR clamp等がある。変異DNAの量が多い場合はリアルタイムPCRによる検出は容易であるが、微量になると検出は難しい。変異特異的プローブは１００%変異DNAのみを検出するわけではなく、通常正常DNAも弱いながら検出する。この検出効率は個々のケースによって異なる。さらに実験条件によりCt値が変化する。これらの事由により検出閾値は保守的な設定にならざるを得ないため、微量の変異DNA検出には限界がある（図２）。また個々の変異ごとの最適化が必要なため、多数の変異部位にこのアプローチを適用することは難しい。

f:id:kkatogo13:20210323133729p:plain — 図２．リアルタイムPCRはデジタルPCRよりも検出効率が劣るため、検出感度が低い（閾値Ct値が低い -> 鋳型DNA量が多いため少ないサイクル数で蛍光検出の閾値を越える）。

これに対しデジタルPCRでは、DNA溶液を限外希釈して一反応系に一分子以下含まれている状態をつくりPCR反応を行う。変異配列と正常配列を別個の蛍光色素で標識したプローブで検出し、反応系の数をカウントすることにより変異及び正常DNAの分子数を測定する（図３）。各反応系は全分子変異あり、あるいは全分子変異なし、なので上記のリアルタイムPCRのような検出閾値の問題は起こらず、微量DNAの検出が可能である。