非重複統合リード塩基配列決定システム：non-overlapping integrated read sequencing system (NOIR-SS) は分子バーコード技術を用いた高精度塩基配列決定システムである。血中腫瘍DNAの塩基配列決定のためにつくった技術である。複数の遺伝子を同時解析する、すなわち遺伝子検査パネルになるシステムだが、２つの大きな特徴がある：１）DNA断片にアダプターを付加、アダプタープライマーと一つの遺伝子特異的プライマーでPCR増幅（anchored PCR）；２）分子バーコード内のエラー処理。
Anchored PCR
遺伝子検査パネルでは、がん関連遺伝子のみに解析対象を限定するために遺伝子を選択するが、multiplex PCRとhybridization captureの２つのアプローチがある。NOIR-SSではmultiplex PCRで多数の遺伝子を一回の反応で増幅してシーケンサーの鋳型DNAを調製する。NOIR-SSのmultiplex PCRでは、DNA断片にアダプターを付加、アダプタープライマーと一つの遺伝子特異的プライマーでPCR増幅を行ういわゆるanchored PCRを採用している（図１）。理由は、アンカーPCRはもともと私自身が開発した方法であること、また通常のPCRプライマーに分子バーコードを埋め込むと増幅効率が低下するためである。
図１. NOIR-SSにおけるanchored PCR。
注. ジョンスホプキンス大学のグループは通常のPCRプライマーの片側に１２塩基の分子バーコードを埋め込む方法（Safe-SeqS）を開発して自身のリキッドバイオプシー研究に用いている。私達もNOIR-SS開発前にこの方法を検討したが、だいたい３分の２のプライマーペアは増幅しなかった。ASCOで当該グループの研究者と会ったときに、この問題について訊いてみたところ、「そのとおり、すべての遺伝子のプライマーセットを用意するのに大変な労力がかかった」という答えであった。NOIR-SSでは通常のPCRと変わらない成功率である。なお、Thermo Fisherも分子バーコードを用いたリキッドバイオプシー用パネルを販売しているが、彼らのシステムでは両側のプライマーに短いバーコード配列を埋め込む事により、バーコード配列による増幅障害の問題を回避している。キアゲンのシステムではNOIR-SSと同じくanchored PCRを用いている。
エラー入り分子バーコードの除去
エラー入りバーコードはリード数が少なく、リード数の多いバーコードにはエラーがないので、バーコードあたりのリード数に閾値を設定して、その閾値以下をエラー入りバーコードとして除去すれば良い（「分子バーコード技術：バーコードに入ったエラーの処理」参照）。NOIR-SSはもともとサーモフィッシャー社製のシーケンサー（PGM, Proton, S5）のために開発しており、これらのシーケンサーは塩基置換よりも挿入欠失の方がずっと多い（およそ１０倍）。従って、エラーはバーコードのサイズで検出可能である。イルミナのシーケンサーのように３塩基からなるバーコード配列を用いる必要はない。図２の実験では１２塩基のバーコードを用いている。
リード数の少ないバーコードが多いが、バーコードあたりのリード数が増えると減少する（図２A）。サイズが１２塩基でないバーコードはリード数/バーコードの小さい領域に集中している（図２C）。リード数/バーコードが増加するに従いエラーの無いバーコードの比率が上昇する（図３D）。適切な閾値（このグラフの場合は１００）以下のものをエラー入りバーコードとして除去する。なお、図２Bは累積リード数だが、リード数の少ないバーコードの領域の総リード数は少ない。この操作によって破棄するリードは全体の１０−２０%程度であり、シーケンシングコストの損失は少ない。
図２．分子バーコード内エラー（挿入欠失）のモニタリングと標的遺伝子の分子数計測。正常バーコードのサイズは１２塩基。A) バーコードあたりのリード数の分布。縦軸、バーコード数；横軸、リード数/バーコード。B) 累積リード数。C) バーコードのサイズ分布。D) １２塩基バーコードの比率。E) エラー入りバーコード除去後の推定標的遺伝子分子数。F) 推定分子数と鋳型DNA量間の相関。
エラー入りバーコードを除去により、分子数計測が可能になる。リード数が少ない間は、リード数増加により推定分子数は増加するが、あるポイントからプラトーに達する（図２E）。プラトー後の推定分子数と反応系に加えた鋳型DNA量と高い相関がある（図２F）。
シーケンサー読み取り精度の向上
分子バーコード使用によりシーケンサー読み取り精度は２０から５０倍向上する（エラー発生頻度が２０分の１から５０分の１になる）（図３）。分子バーコード使用による精度、エラー発生頻度は１０万塩基に１娘程度であり、耐熱性DNAポリメラーゼの違いは影響しない。
図３．PCR増幅酵素のシークエンスエラー率への影響。Tag(+)、バーコード使用；Tag(-)、バーコード使用せず；Q5、Q5 DNAポリメラーゼ（NEB）；Pt、Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity kit（サーモフィッシャー）；DS、両鎖に分子バーコードを付加した場合（Q5 DNAポリメラーゼ使用）。
図４．NOIR-SSと通常の次世代シーケンシングの比較。縦軸、正常配列とことなる塩基の比率；横軸、TP53塩基配列部位。７４７位のGがCに置換している。
胃癌患者DNAのTP53の配列をNOIR-SS（図４上段）と通常の次世代シーケンシング（図４下段）で行った。変異以外のバックグラウンドエラーが完全に抑えられた。
Availability
株式会社DNAチップ研究所がNOIR-SSの研究受託サービスを提供している。
NOIR-SSの文献
Kukita, Y., Matoba, R., Uchida, J., Hamakawa, T., Doki, Y., Imamura, F. and Kato, K. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Research. 22 (2015) 269-277. DOI: 10.1093/dnares/dsv010
Anchored PCRの文献
Kato, K. Adaptor-tagged competitive PCR: a novel method for measuring relative gene expression. Nucleic Acids Res. 25 (1997) 4694-4696.
Kato, K. RNA fingerprinting by molecular indexing. Nucleic Acids Res. 24 (1996) 394-395.
Kato, K. Description of the entire mRNA population by a 3’ end cDNA fragment generated by class IIS restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 23 (1995) 3685-3690.
