次世代シーケンサー技術の主な課題は、一つは長い領域の配列決定、もう一つは読み取り精度の向上である。読み取り精度についてはリキッドバイオプシーに応用するために、徹底的に研究が行われた。その研究成果をふまえ、３つのトピックスについて解説する。
DNA損傷：酸化（８-オキソグアニン）と脱アミノ化
そもそも鋳型DNAに損傷があって塩基置換が起こると、正確には読めない。主なDNA損傷の原因の一つは酸化である。８位のアミノ基が酸化されて８-オキソグアニン 8-oxoguanine できる。グアニン guanine はシトシン cytosine と塩基対をつくるが（図１A下）８-オキソグアニンはアデニンと塩基対をつくるため（図１A上）、G-C→A-Tの置換がおこる。もう一つは脱アミノ化で、シトシン cytosine のウラシル uracil への変換である（図１B）。
図１．DNA損傷。A、酸化、赤丸は損傷部位。B、脱アミノ化。
これらのDNA損傷は、およそ１０万塩基に１箇所の頻度である。リキッドバイオプシーの技術開発時にDNA損傷が頻発する、という問題が発生した。遺伝子検査パネルでは、がん関連遺伝子を選択するが、選択方法として２つのアプローチがある。ひとつはmultiplex PCRで、一つの反応系で多数の遺伝子断片を増幅する。もう一つは hybridization capture で、集めたい遺伝子配列の人工核酸（ベイト bait）をつくり、hybridization で遺伝子断片を収集する。hybridization capture は高温（〜６５°C）でDNAを長時間保温するため、その間にDNA損傷が起こる。ガーダント・ヘルス社等は正常DNAの配列を多数配列決定してDNA損傷の起こりやすい塩基部位を同定、その部位を変異から除く、という方法でこの問題を解決してる。
耐熱性DNAポリメラーゼ
代表的な耐熱性DNAポリメラーゼにはTaq DNAポリメラーゼと KOD DNAポリメラーゼがあるが（「PCRに必要なアイテム 〜 耐熱性DNAポリメラーゼと遺伝子増幅装置」）、前者は好熱細菌 Thermus aquaticus 由来だが、後者は古細菌Thermococcus kodakarensis 由来で系統が全く異なる（生物は細菌、古細菌、真核生物の３つの系統に分けられる）。DNA ポリメラーゼの酵素学的性質は両者で大きく異なり、一般に細菌由来のポリメラーゼはポリメラーゼ活性（正確には５’→３’DNAポリメラーゼ活性）のみだが、古細菌由来のポリメラーゼは５’→３’DNAポリメラーゼ活性以外に３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を持っている。DNA合成における３’→５’エクソヌクレアーゼ活性の役割を図２に示した。ポリメラーゼが間違った塩基を取り込んだ場合Taq DNAポリメラーゼはそのまま合成を続ける（図２上）。しかしKOD DNAポリメラーゼの場合は、３’→５’エクソヌクレアーゼが誤って取り込まれた塩基を除去して、その後でポリメラーゼが正しい塩基を取り込んで合成を継続する（図２下）。
図２．Taq DNAポリメラーゼ（上）とKOD DNAポリメラーゼ（下）の違い。
これがDNA合成における校正 proof reading であり、KOD DNAポリメラーゼは校正機能を持っているが、Taq DNAポリメラーゼは持っていない。そのため正確性はKOD DNAポリメラーゼのほうが１０〜５０倍ほど高い。正確性は測定条件によって異なるが、Taq DNAポリメラーゼは１０００塩基に１回程間違えるので、KOD DNAポリメラーゼは１万塩基あるいは５万塩基に１回程度の間違いである。
耐熱性DNAポリメラーゼでは正確性だけではなく処理能力（一回のDNA分子への結合でとりこまれる塩基数で評価する）も重要である。Taq DNAポリメラーゼは高い処理能力を持っている。校正機能付耐熱性DNAポリメラーゼは一般に処理能力は低いが、KOD DNAポリメラーゼは例外的に高い処理能力を持っている。Taq DNAポリメラーゼと校正機能付き耐熱性DNAポリメラーゼを混合すれば、高い処理能力と高い正確性を兼ね備える耐熱性DNAポリメラーゼをつくる事ができる。開発初期の頃は、この方法が効果的であった。最近では、いろいろな校正機能付き耐熱性DNAポリメラーゼが単離され、また遺伝子改変で高機能化したポリメラーゼが開発されており、選択肢は豊富である。自身が経験のあるものでは、NEBのQ5 DNA polymeraseは非常に優れた酵素である。技術の実用化を考えた場合は、KOD DNAポリメラーゼが国産であるため扱いやすい。KOD DNAポリメラーゼにもいろいろな改良型が市販されているが、プロトタイプの KOD –plus- で大体満足した結果が得られる。
分子バーコード技術
次世代シーケンサーを用いた塩基配列決定では、同じ領域を多数回読んでコンセンサス配列をつくると、エラーが相殺されて正確な配列を決定することができる。生殖体系列のヒトゲノム配列解析の場合は、２つのアレルが１：１の比率であるため、この方法で両方のアレルの配列を正確に決定できる。ところが、がんゲノムの場合は変異アレルの比率が低いケースが多い。特に血中腫瘍DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）の場合は１％以下のケースも多く、単純なコンセンサス配列決定では変異を検出できない。
この問題を解決するために導入されたのが分子バーコード技術である（図３）。例えば、それぞれの塩基がA, C, G, Tの混合物である１２塩基の配列を血漿DNAに付着させると各分子は別々の１２塩基配列で標識（分子バーコード）される（図３上）。そのあとでPCRをおこなうと各分子由来の増幅物は同一の分子バーコードを持つことになる。分子バーコードにより塩基配列をグループ化すると、変異はすべての塩基配列に出現するが、読み取りエラーは一部の配列にしか現れないので、区別することができる（図３下）。
図３．分子バーコード技術。
この技術により実験操作過程（PCRとシークエンシング）のエラーをほぼ完全に除去できるようになった。分子バーコード技術を用いたどの報告でも、エラー率は大体１０万分の１であり、この低頻度エラーは鋳型DNA分子の損傷によるものと思われる。また耐熱性ポリメラーゼのエラーに関してもかなり頑強で、KOD DNAポリメラーゼとQ5 DNAポリメラーゼ（正確性はKOD DNAポリメラーゼのおよそ１０−５０倍と云われている）でもエラー率はあまり変わらない。Taq DNAポリメラーゼに関してはデータをとっていないが、流石にエラーが増加する、と思われる。なお、分子バーコード技術の発明者はシドニー・ブレンナー Sydney Brenner 博士（２００２年ノーベル賞受賞、１９８７−２０１９）である。
塩基配列決定の精度に関してはリキッドバイオプシーへの応用のために極限まで技術開発が行われ、短いDNA断片（<４００塩基対）については解決した感がある。より長いDNA断片に関しては改良の余地はあるが、長い領域の精度向上に関しては特に大きなニーズはないので、別方向の技術開発、たとえばスループットの向上、を行うべきであろう。
